非病毒载体与基因敲入技术，CAR-T下一代升级之路？

2020年8月14日/医麦客新闻 eMedClub News/--2018年CAR-T元年，国内CAR-T驶入快车道两年，迄今为止，有26家公司拿到临床注册批件，复星凯特已向药监局提交旗下CAR-T细胞的上市申请，有望成为国内首个上市的CAR-T产品。然而，根据CAR-T现有的临床表现，无论是国内还是国外，都存在三大痛点，其一，高昂的成本；其二，安全性在某些适应症上仍有挑战；其三，治疗后易复发。那么，CAR-T是否有下一代升级的可能呢？

升级之路一：非病毒载体递送系统

非病毒载体技术由来已久，目前国内外存在的几种制备CAR-T细胞的非病毒载体如下，以POSEIDA/上海细胞治疗集团为代表的piggyBac非病毒载体（PB转座子）、以Ziopharm/ Precigen为代表的Sleeping Beauty非病毒载体（SB转座子）和以宾夕法尼亚大学Carl June团队为代表的mRNA载体。各技术对比如下表所示：

非病毒载体对比病毒载体生产制备的CAR-T细胞治疗产品，生产工艺简化。相对于病毒载体系统而言，非病毒载体系统的生产工艺更加简单、容易进行质量控制。同时在存储上面来说，非病毒载体所使用的质粒DNA或mRNA稳定性更高，存储的要求也比病毒载体系统的RNA病毒更低，有效期更长。生产简化后的成本优势凸显。病毒载体制备的CAR-T细胞涉及众多的生产和质量控制步骤，成本高昂，以上市的Kymriah和Yescarta为例，售价300多万人民币，如无医保患者难以承担。

Poseida：近期登录纳斯达克，完成1.5亿美元的募资。基于非病毒载体开发的P-BCMA-101（靶向BCMA）项目推进至临床II期，另一个非病毒载体项目P-PSMA-101已经完成对于转移性去势抵抗前列腺癌患者的临床试验的首位患者给药。

上海细胞治疗集团：于2019年1月申报的以CD19为靶点的CAR-T细胞治疗新药“非病毒载体CD19 CAR-T细胞注射液（BZ019）”正式获IND受理。2019年4月“非病毒载体CD19 CAR-T细胞注射液（BZ019）”获得药监局许可开展临床试验。2019年11月细胞集团携手中国医学科学院血液病医院于天津正式举办非病毒载体靶向CD19嵌合抗原受体T细胞注射液（BZ019）注册临床研究启动会。

Ziopharm Oncology：共三项基于其睡美人转座子技术的CAR-T项目获得FDA批准进入临床试验，分别是：第二代CD19 CAR-T细胞用于CD19阳性白血病和淋巴瘤患者、TCR-T细胞疗法用于实体肿瘤、表达mbIL-15的CD19 CAR-T细胞用于CD19阳性白血病和淋巴瘤患者。

Precigen：基于睡美人转座子技术的CAR-T细胞项目PRGN-3005和PRGN-3006都已经进入临床研究阶段并在去年中下旬完成了首例患者给药。PRGN-3005用于针对晚期、复发性铂耐药卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者，PRGN-3006用于复发或难治性急性髓性白血病（AML）和高风险骨髓增生异常综合征（MDS）治疗。

Carl June团队：2014年由Carl June领导的小组在临床试验中，通过将靶向间皮素（Mesothelin）的CAR mRNA顺转进病人T细胞，结果发现一例胰腺癌转移的晚期病人和一例晚期间皮瘤病人均获得显著治疗效果，没有发生脱靶毒性。

升级之路二：基因敲入技术

基因敲入技术在CAR-T中的应用近两三年才出现，目前技术主要被国外的头部基因编辑技术公司掌握。为代表的是Sangamo Therapeutics利用ZFN结合腺相关病毒AAV实现高效基因插入，Precision Bioscience公司利用ARCUS基因编辑技术结合AAV实现，Fate Therapeutics公司利用CRISPR-Cas9基因编辑技术结合AAV病毒实现，Bluebirdbio通过megaTAL基因编辑技术结合AAV实现。各技术对比如下：

基因敲入技术在细胞治疗领域中目前主要应用在通用型CAR-T上，其可用一步法实现CAR基因的敲入和TCR基因敲除。其次，基因敲入技术理论上可提升CAR-T治疗的有效性。有证据表明将CAR基因整合入TRAC基因组位点可在小鼠模型中极大提升CAR-T的疗效；另外Carl June团队发现若在CAR基因随机插入TET2基因组位点，则可以使病人长期获益。其三，定点插入技术可避免因随机插入而带来的癌变风险。

Sangamo Therapeutics：2018年2月，Gilead/Kite与Sangamo Therapeutics共同宣布，两家公司已经达成全球合作，前者将使用后者的的锌指核酸酶(ZFN)技术平台开发下一代治疗不同肿瘤的自体和异体细胞疗法。作为编辑免疫细胞的工具，基因编辑的出现有希望开发能潜在改善安全性、疗效和效率的治疗方法。

Precision Bioscience：该公司于去年ASH上汇报了基于定点整合CD19通用型CAR-T治疗复发难治急性淋巴白血病和非霍奇金淋巴瘤的临床结果。结果显示，治疗的3例急性淋巴白血病中1例实现完全缓解。治疗的6例非霍奇金淋巴瘤中2例完全缓解，4例部分缓解。

Fate Therapeutics：FT819源自iPSC克隆细胞系，其具有完全消除的T细胞受体(TCR)表达，以及插入到T细胞受体α恒定(TRAC)位点的靶向CD19的新型CAR-T。该候选细胞产品正在与Michel Sadelain博士领导的纪念斯隆·凯特琳癌症中心(MSK)合作开发。FT819是该公司首个现货的、iPSC衍生的CAR-T，预计于2020年下半年提交IND。

新锐公司酝酿升级之路

西安桑尼赛尔生物医药（Sunnycell Therapeutics Co., Ltd）采用非病毒定点整合CAR-T技术 (non-viral Genome Targeting CAR-T, nvGT CAR-T™)，不同于主流非病毒载体（转座子系统）技术，其利用基因编辑作为递送系统，将CAR基因定点整合至T细胞特定基因组位点制备CAR-T。此过程无需依赖病毒载体，故此技术兼具非病毒递送系统和基因敲入技术的两大优势，这是基因编辑技术（定点敲入技术）首次应用在自体CAR-T细胞治疗上，有望成为下一代自体CAR-T。

同现有病毒载体、主流非病毒载体系统相比，nvGT CAR-T™技术优势主要体现在成本优势、CAR-T治疗的安全性的提升，和潜在疗效上的获益：

首先，与非病毒载体递送系统的优势一样，nvGT CAR-T的生产过程省去质粒和病毒生产制备，即无需建立细胞库、发酵、过滤、超滤、层析等繁琐步骤，厂房建设和设备投入费用大大降低，且无需组建庞大生产团队。非病毒载体仅需两步即可完成生产和纯化，单个产品的载体工艺开发时间可由传统的数月缩短为两至三星期，大大降低时间成本。另外，nvGT载体稳定性更高，存储的要求也比病毒载体更低，有效期更长。

其次，由于经基因定点敲入技术整合的CAR基因受控于内源启动子调控，表达接近于天然T细胞状态，更温和，使得CAR-T治疗的安全性极大提高。癌变风险和病毒残留风险也随之降低。最后，可能的疗效上的获益。临床前试验证明，通过非病毒定点整合技术制备的CAR-T细胞在培养和扩增过程中几乎不产生细胞耗竭标记物，因此能在体内存留更长的时间维持疗效，而病毒载体制备的CAR-T细胞耗竭是导致患者复发的很重要的原因。

目前西安桑尼赛尔正在同国内某知名三甲医院血液科开展靶向CD19非病毒定点整合CAR-T（Anti-CD19 nvGT CAR-T™）治疗复发难治急性淋巴白血病的临床研究，已入组患者数人。已完成的临床数据显示Anti-CD19 nvGT CAR-T™在高危、高负荷复发难治急性淋巴白血病患者的治疗中表现出极高的完全缓解率和卓越的安全性。详细的临床数据预计将于今年底美国血液年会（ASH）上发布。期待西安桑尼赛尔报告的临床结果能够为解决行业痛点带来一些希望，让我们拭目以待。

8月21日（周五）20：00-21：00，医麦课堂邀请了西安桑尼塞尔生物医药CEO、首席科学家彭作翰博士，为您带来“下一代CAR-T升级之路——非病毒载体与基因敲入技术略谈”为主题的课程。

本次课程从CAR-T行业痛点出发，总结目前非病毒载体和基因敲入技术在CAR-T细胞治疗中的应用，并且重点介绍该领域的国际最新进展，以此与行业众多同行交流碰撞，一起推动细胞治疗领域的新技术革命。

授课专家简介：彭作翰，北京大学医学部病理系博士，博士期间主要从事肿瘤的发病机理研究。后任职于恒瑞医药，负责肿瘤免疫项目开发。2017年7月于西安创立了桑尼赛尔生物医药，任CEO兼首席科学家。同时受聘于西北大学生命科学与医学部，任研究员、肿瘤免疫治疗中心主任。

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